易基因：NAR：RCMS编辑系统在特定细胞RNA位点的靶向m5C甲基化和去甲基化研究｜项目文章

喜讯！���基因表观转录组学RNA-BS技术服务见刊《核酸研究》

大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。

2024年2月15日，吉林大学张涛、赵飞宇、李金泽为共同第一作者，吉林大学李占军、隋婷婷及赖良学为共同通讯在《Nucleic Acids Research》（NAR/ IF14.9）发表题为“Programmable RNA 5-methylcytosine (m5C) modification of cellular RNAs by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase”的研究论文，通过m5C RNA-BS等分析揭示RCMS（reengineered m5C modification system）编辑系统能够精确地在特定RNA位点掺入或去除m5C修饰，改变细胞转录本的稳定性。此外，RCMS编辑系统还调控tRNA m5C水平，影响细胞的转录本丰度、细胞增殖和迁移能力。

标题：Programmable RNA 5-methylcytosine (m5C) modification of cellular RNAs by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase（通过dCasRx偶联的甲基转移酶和去甲基化酶实现细胞RNA的可编程m5C修饰）

时间：2024.2.15

期刊：Nucleic Acids Research（核酸研究）

影响因子：IF 14.9

实验方法：RT-qPCR、Western blot、流式细胞术、mRNA BS-seq、免疫荧光显微镜和RNA衰变实验等（易基因科技为本研究提供mRNA BS-seq建库测序分析技术服务）

研究摘要：

5-甲基胞嘧啶（m5C）是一种丰富的RNA修饰，在调控RNA命运和基因表达中起着至关重要的作用。尽管最近在理解m5C的生物学作用方面取得了进展，但无法在转录本中的特异性位点引入m5C阻碍了揭示特异性m5C与表型结果之间直接联系的研究。本研究作者开发了一种基于CRISPR-Cas13d的编辑系统，名为重编程m5C修饰系统（reengineered m5C modification system，简称RCMS），用于特定转录本中的靶向m5C甲基化和去甲基化。RCMS编辑系统由核定位的dCasRx与甲基转移酶（NSUN2/NSUN6）或去甲基化酶（小鼠Tet2的催化结构域）（ten-eleven translocation 2，TET-2）结合而成，可以在精确m5C位点操纵甲基化事件。研究揭示了RCMS编辑系统可以诱导特异性m5C甲基化和去甲基化。此外研究还证实了RCMS编辑系统在调控转运RNA m5C水平以及通过m5C介导的机制诱导转录本丰度和细胞增殖变化的能力。研究结果共同将RCMS编辑系统确立为一种靶向表观转录组编辑工具，有助于鉴定单基因m5C变化及其可能产生结果。对于深入理解RNA修饰在生物学过程中的作用以及开发新的治疗策略具有重要意义。

图形摘要

研究结果：

（1）可编程m5C编辑系统设计

• NSUN6酶验证可编程位点特异性m5Cwriter活性

  图1：NSUN6在HEK293T细胞中验证可编程位点特异性m5C writer活性。

  1. 将NSUN6甲基转移酶与dCasRx结合以构建RCMS-dCasRx-NSUN6编辑器。
  2. RCMS策略。该策略涉及使用与NSUN6甲基转移酶结合的可编程RNA结合蛋白，如dCasRx，通过靶转录本中特定gRNA方式，诱导从C到m5C的位点特异性甲基化。
  3. RPSA mRNA中m5C位点和gRNA靶向区域示意图。
  4. 通过RT-qPCR使用CasRx评估RPSA gRNA的靶向效率（n=3）。
  5. 使用HiTOM深度序列分析评估RCMS dCasRx-NSUN6编辑器靶向m5C甲基化后RPSA m5C位点的m5C比率水平（n=3）。
  6. 在HEK293T细胞中，使用与非靶向gRNA或RPSA gRNA结合的dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6评估RPSA mRNA水平（n=3）。
  7. 用dCasRx-NSUN6或dCasRx-dNSUN6联合非靶向gRNA或RPSA gRNA分析HEK293T细胞中RPSA的蛋白水平。
  8. 在用10 mg/ml放线菌素D（一种有效的转录抑制剂）处理的HEK293T细胞中，通过RT-qPCR检查指定时间点的RPSA水平（n = 3）。

  “非靶向gRNA”被用作非靶向对照。误差线表示平均值±SD。*P